Medical practices evolved over millennia, from ancient civilizations like Egypt and Mesopotamia to the groundbreaking
病毒樣顆粒（VLP）疫苗是一種基于病毒結構但不含病毒遺傳物質的疫苗技術。它們通過模擬天然病毒的形態和表面抗原，激發強烈的免疫反應，同時因無法復制而具有更高的安全性。VLP疫苗是傳統疫苗（減毒活疫苗和滅活疫苗）的更好替代品。VLP疫苗無法在體內復制，因此適用于包括孕婦或免疫系統受損的所有人。此外，來自具有分段基因組的病毒（如流感病毒、非洲馬瘟病毒和藍舌病病毒）的衣殼蛋白（包括其他結構蛋白）也可用于開發VLP疫苗，而無需擔心像減毒活疫苗一樣的基因重組問題。其次，VLPs能夠模擬真實病毒結構，而不像滅活疫苗，其結構蛋白可能在滅活過程中被修飾，從而導致免疫原性受損。
圖1.VLPs和嵌合型VLPs的形成機制
VLP疫苗的特點
1.結構類似天然病毒：VLPs由病毒的一個或多個結構蛋白（如衣殼蛋白）自組裝形成，大小和形態與真實病毒相似。
2.無感染性：不含病毒基因組，無法復制或致病。
3.高免疫原性：顆粒結構能被免疫系統高效識別，激活B細胞和T細胞反應。可誘導中和抗體和細胞免疫（如HIV、HPV疫苗）。
4.安全性高：適用于免疫功能低下人群（如乙肝VLP疫苗）。
圖2.已上市的VLP疫苗
VLP疫苗的生產系統
1.昆蟲細胞-桿狀病毒系統：
優點：高產量、成本低、適合復雜蛋白組裝。
應用：HPV疫苗、埃博拉疫苗。
2.哺乳動物細胞（如HEK293細胞）：
優點：翻譯后修飾更接近人類，適合包膜VLPs（如流感疫苗）。
3.酵母系統（如畢赤酵母）：
優點：快速、低成本，已用于乙肝疫苗。
4.植物系統（如煙草葉綠體）：
環保且可擴展，正在研發中（如諾如病毒VLP疫苗）。
VLP疫苗下游純化工藝
VLPs表達系統的多樣性導致下游純化工藝不具有普適性。圖3為一般下游工藝流程圖。
圖3.VLP疫苗的下游工藝流程
收獲與澄清：
在細胞培養生產出的各種培養液中，除了含有大量目標物質以外，還存在許多細胞組織碎片及代謝產物等雜質，使得培養液呈現混濁或半混濁狀態，如果直接用這種培養液進行濃縮操作，將會很快使超濾膜阻塞，而無法完成培養液的濃縮，并致使超濾膜報廢。因此，培養液在濃縮之前，首先必須進行澄清處理，去除培養液中的大顆粒雜質，使其成為半透明或透明溶液，用這樣的培養液進行濃縮，才可能使濃縮過程正常進行，確保超濾膜的使用壽命。培養液濃縮前的澄清處理是濃縮過程中一個關鍵的技術環節。
高效的澄清步驟需要兼具較高的固體顆粒去除能力以及較高的產品收率、易于放大、并且能夠保護后期下游操作裝置。
方法：
離心：差速離心去除大顆粒。
深層過濾：使用多級濾器（如1.2μm→0.45μm）澄清上清。
切向流過濾（TFF）：適用于大規模生產，可濃縮樣品并去除小顆粒雜質。
在培養規模過大時，離心耗時長，深層過濾需要大量的深層濾膜，導致耗材的成本大幅增加。同時，對于高密度的細胞培養會使深層濾膜的載量降低，從而導致成本增加以及產品過度稀釋。
TFF膜組件有平板膜包及中空纖維兩種。TFF是由跨膜壓差驅動，小于膜孔徑的物質和雜質透過膜，而顆粒較大的細胞等雜質被截留。一般用于微濾澄清的膜孔徑為0.45/0.22μm。中空纖維切向流微濾澄清可以直接處理高固含量料液，如高密度細胞培養液，可以省去離心和預過濾等步驟，步驟少，操作簡單，膜通過清洗可反復使用，降低了設備投資和操作成本，符合模化自動化生產的要求。
超濾濃縮（TFF)：
目的：減少層析處理量，提高層析效率，保護層析柱。
一般情況下，應用超濾法（TFF）可使VLP濃縮100倍以上，雜蛋白去除率達99%。其中，中空纖維膜過濾技術具有溫和低剪切力、不易堵塞、操作靈活、壽命長成本低、易于放大等優點，因此濃縮純化VLP建議選擇中空纖維。
使用超濾法進行濃縮純化，選擇合適的膜孔徑至關重要，膜孔徑直接決定了濃縮的效率和產品質量。一方面需要選擇膜孔徑能夠使目標分子有效截留以保證收率，另一方面要充分考慮雜蛋白的去除效果和處理速度。因此最佳的原則為：選擇可以截留目標分子的孔徑最大的膜，并且盡量選擇孔徑分布均一的濾膜。
初級純化：
1.沉淀法
聚乙二醇（PEG）沉淀：選擇性沉淀VLPs，需優化PEG濃度和鹽濃度以平衡收率與純度。
2.色譜層析
親和層析：
肝素親和：利用VLPs表面負電荷特性（如HPV VLP）。
抗體偶聯層析：特異性高但成本昂貴。
離子交換層析（IEX）：依據VLP表面電荷特性選擇陰離子交換（如Q柱）或陽離子交換（如SP柱），需優化pH和鹽梯度以避免顆粒聚集。
疏水相互作用層析（HIC）：基于VLPs表面疏水性，適合某些非包膜VLPs。
精細純化：
分子排阻色譜（SEC，凝膠過濾）：
去除殘留宿主蛋白、核酸或聚集體，同時緩沖液置換。分辨率高但通量低，通常作為最終精純步驟。
多模式層析：
如Capto Core系列樹脂，結合離子交換與分子篩效應，可一步去除多種雜質。
病毒滅活/核酸去除（若需）：
核酸酶處理：如Benzonase降解宿主DNA/RNA。
UF/DF：配合TFF系統去除小片段核酸及酶。
濃縮與制劑：
切向流過濾（TFF）：
濃縮至目標滴度，同時置換緩沖液（如PBS或制劑緩沖液）。
無菌過濾：
0.22μm濾膜過濾確保無菌性。
典型案例
以下是典型VLP疫苗的下游純化工藝。
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